Insgesamt hat jeder Mensch 46 Chromosomen, davon hat er jeweils 23 von der Mutter und 23 vom Vater geerbt. Immer 2 Chromosomen beinhalten dieselbe Erbinformation – aber immer mit kleinen Variationen. 2 der 46 Chromosomen sind X oder Y-Chromosomen. Die Konstellation XX ergibt weibliche Individuen und die Konstellation XY männliche Individuen.Durch verschiedene Anordnungen innerhalb der Chromosomen kann sich die DNA eines jeden Individuums unterscheiden. Davon ausgenommen sind nur eineiige Zwillinge. Man kann davon ausgehen, dass ungefähr 50% aller Chromosomen einer Person mit 50% der Mutter bzw. des Vaters übereinstimmen.

Dadurch wird gewährleistet, dass durch einen Vergleich der DNA des Vaters und des Kindes - die Mutter ist nicht zwingend für einen Vaterschaftstest notwendig, erhöht jedoch die Aussagekraft des Tests - eine Vaterschaft bestätigt oder ausgeschlossen werden kann. Für diesen Vorgang werden bestimmte Regionen der DNA untersucht (in der Regel 16 Regionen) welche sich wiederholende Sequenzen beinhalten. Dabei sind diese von Person zu Person unterschiedlich.

Vorab wird die DNA (die zu untersuchenden Regionen) vervielfältigt, um Sie nachher erkenntlich zu machen und die Länge feststellen zu können. Um dieses zu erreichen bedient man sich der PCR Methode (Polymerase Kettenreaktion). Diese kann sich ähnlich einer Zellteilung vorstellen: Aus 2 Zellen werden 4, aus 4 wird 8, aus 8 werden 16 usw. Bei 30 Durchläufen hätte man dann theoretisch 1 Milliarde identische Kopien. Gleichzeitig erfolgt eine farbige Markierung mit Fluoreszenz-Farbstoffen um diese später durch einen einfarbigen Laser zu identifizieren und die Länge zu bestimmen. 

Um eine statistische Auswertung zu erlangen werden diese Informationen nun zusammengeführt und anhand der Übereinstimmungen der Regionen die Wahrscheinlichkeit für eine mögliche Vaterschaft zu berechnet. Dazu bedient man sich der verschiedenen möglichen Konstellationen dieser Identitätsmerkmale in der Bevölkerung. Zu diesem Zweck wird die Verteilung der verschiedenen möglichen Varianten der Identitätsmerkmale in der Bevölkerung herangezogen. Da die Verteilung für jede Variante unterschiedlich ist (d.h. es gibt Varianten, die nur in wenigen Menschen vorliegen, und solche, die in vielen Menschen vorliegen), ist die Wahrscheinlichkeit einer zufälligen Übereinstimmung zweier Menschen bei allen Vaterschaftstests anders. Man geht davon aus das eine Übereinstimmung zweier nicht verwandter Personen extrem unwahrscheinlich ist und unter 0,001% liegt.